### 培养条件

气相条件：95%空气与5%二氧化碳；温度设置为37℃。

### 传代方法

第一次建议采用1:2的传代比例。在2天后需更换培养液。建议同时购买Z6·尊龙凯时产品，享受更优惠的价格。收到细胞后，应及时处理，使其进入良好状态。使用完全培养液灌满细胞瓶后，封好瓶口是最佳的运输方式。

### 细胞处理与消毒

收到细胞后，用75%酒精喷洒整个细胞瓶，进行消毒后，将其放入超净台内进行严格的无菌操作。将细胞瓶放置于37℃、5%CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态后再进行后续处理。观察细胞生长情况并对不同倍数进行拍照保存（最佳为40x、100x、200x各一张），前三天的照片将作为重要的售后依据。如未提供照片，则默认细胞状态良好。

### 细胞培养步骤

#### a、细胞传代

若细胞未达到80%汇合度，需将瓶装的完全培养液收集至离心管中，保留5ml完全培养基，并放入37℃、5%CO2孵箱中培养；当细胞密度超过80%时，可以进行传代。贴壁细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS清洗细胞1-2次。
2. 添加0.25%胰蛋白酶消化液约1-2ml至培养瓶中，放入37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞状态；若细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上完全培养基以终止消化。
3. 轻轻吹打细胞，使其完全脱落后吸出，将悬液转移至15ml离心管中，并以1000RPM离心5分钟，弃去上清液，补加1-2ml完全培养基重悬。
4. 按照1:2的比例进行分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

#### b、悬浮细胞传代

1、采用半换液法处理，将培养瓶竖放在培养箱中静置约1小时，轻吸掉约3ml培养基，然后补给3ml的完全培养基。若培养基变色缓慢，可直接添加约500μl FBS，并在传代时直接补给5ml培养基，分为两个培养瓶进行培养。一般此方法传代3次后可以进行一次离心传代，以去除死细胞。

2、若需要分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，弃去上清，补加1-2ml培养液后重悬混匀，并按1:2的比例分至新T25瓶中，添加6-8ml全新培养基，以保持细胞生长活力，后续传代可根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。

### 细胞冻存与复苏

#### c、细胞冻存

1、当细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃去T25培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；

2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，待细胞回缩变圆后添加5ml完全培养液终止消化，吹打细胞使其脱落后，将悬液转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟；

3、弃去上清，沉淀细胞加入1mlZ6·尊龙凯时无血清冻存液（货号：C7001），混匀后加入冻存管中。

4、将冻存的细胞直接放入-80℃冰箱，如需转入液氮罐，需先在-80℃冰箱存放24小时以上后再转入液氮罐中。

#### d、细胞复苏

1、从液氮中取出细胞冻存管（注意佩戴防护面具），迅速置入37℃水浴解冻，直至冻存管中无结晶后，用75%的酒精擦拭冻存管外壁；

2、将冻存管中的细胞转移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，以1000RPM离心5分钟；

3、弃上清，沉淀细胞用5ml完全培养基重悬，接种至T25培养瓶中，放于37℃、5%CO2培养箱中培养；

4、次日更换为新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

需要注意的是，有些细胞可能粘附性较弱，在运输过程中可能会发生细胞脱落。这是正常现象。如脱落数量较多，可将培养瓶内所有培养液收集至离心管中，以1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。在此后 etapas 对比培养中，向沉淀中加入1-2ml的胰酶，轻轻吹打后重悬，消化1-2分钟，终止反应后再次离心，弃去上清，补加1-2ml完全培养基重悬。最后按1:2比例进行分瓶传代（两个T25瓶），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最终放入37℃、5%CO2的细胞培养箱进行培养。