mRNA技术作为一种新兴的生物技术，展现出巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这项技术为疾病的预防和治疗开辟了全新的思路。然而，mRNA技术的发展并非一帆风顺，其中最大的挑战之一便是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，会引发机体的免疫反应，从而影响mRNA的安全性和有效性。因此，如何减少dsRNA的形成，成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统的解决方案往往依赖繁琐的纯化工艺，这些方法不仅成本高、效率低，且难以彻底清除微量的dsRNA。作为mRNA体外转录（IVT）的核心酶，T7RNA聚合酶（T7RNAP）的天然活性，如末端转移酶和RNA依赖的RNA聚合酶活性，被认为是dsRNA形成的关键因素。因此，通过定向进化或理性设计改造T7RNAP，成为全球科研团队竞逐的焦点。

在2024年3月3日，我们的团队在FEBS Journal上发表了一项研究论文，标题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》。通过对T7RNAP的工程化改造，我们显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成，仅为野生型的18%。同时，我们大幅提升了合成mRNA的整体效率和质量，这为基因治疗和疫苗开发领域的跨越式发展奠定了基础。

我们创新性地结合了定向进化和半理性设计的方法，成功筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现出色。我们构建了随机突变库，并设计了一个实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，通过荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终，我们筛选出了关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），它们产生的dsRNA含量显著低于野生型。

此外，我们还采用半理性设计方法，构建了十个单点饱和突变库，并利用微孔板筛选技术识别有益的突变体。在筛选了超过1000个突变体后，我们发现了关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q），它们产生的dsRNA含量明显低于野生型，且未影响转录效率。

针对上述突变位点，我们进一步构建了DNA重组文库，通过微孔板筛选，最终获得了组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007ng/μg。这一结果不仅在体外实验中得到验证，还在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低和蛋白翻译效率提升。我们将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞，发现最优突变体M11引发的干扰素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表达量，仅为野生型的97%和1293pg/mL。在HEK293细胞中，突变体mRNA的EGFP表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA能够有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA治疗的潜力。

为深入理解突变体降低dsRNA的作用机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示，这些突变体通过降低RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端转移酶活性，从而减少了dsRNA的生成。这一发现为未来进一步优化T7RNAP提供了重要的理论依据。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法与思路，也为mRNA技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的形成，我们提升了mRNA的质量和安全性。在此基础上，我们成功推出了一款大幅降低dsRNA含量的GMP级别的T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNAPolymeraseGMP-grade(lowdsRNA,250U/μL)）。该产品在mRNA疫苗、mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，为生物医学领域带来更多的可能性。

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