## 培养条件

细胞培养所需条件为DMEM培养基添加10% FBS及1% P/S，用于贴壁细胞的培养。培养温度设定为37℃。针对细胞传代，首次建议使用1:2的比例进行传代。

### 细胞传代及培养步骤

在细胞培养的过程中，建议在两天后更换一次培养液。为了获取最佳的细胞运输效果，建议同时购买Z6·尊龙凯时的细胞产品。在接收到细胞后，首先用75%酒精对整个细胞瓶进行喷洒消毒，随后在超净工作台内进行无菌操作。将细胞瓶放入37℃、5% CO2的培养箱中静置3-4小时，以稳定细胞状态，之后再进行处理。

显微镜观察细胞的生长情况，并对不同倍数的细胞进行拍照记录（建议使用40x、100x及200x的放大倍数各拍一张）。前三天的照片是售后服务的重要依据，未提供照片的情况下，默认细胞状态良好。

细胞传代步骤如下：

1. 弃去培养上清，使用不含钙、镁的PBS冲洗细胞1-2次。
2. 加入约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察细胞状态；若细胞大部分变圆并开始脱落，迅速取回操作台，轻敲培养瓶后加入5ml以上的完全培养基终止消化。
3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落，吸出细胞悬液，转移至15ml离心管中，在1000 RPM离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml的完全培养基重悬细胞。
4. 将细胞悬液按1:2的比例分到新瓶中（两个T25瓶），补充6-8ml新的完全培养基，最后放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中。

对于悬浮细胞的传代，可以采用以下步骤：

1. 采用半换液法，竖着培养瓶在培养箱静置约1小时，轻轻吸去3ml左右的培养基，补充3ml的完全培养基。如果培养基颜色变化慢，可直接加入约500μl的FBS。传代时，可直接补充5ml培养基于两个新培养瓶中，通常经过3次传代后进行离心。
2. 如需分瓶，请将细胞悬液收集到离心管中，1000 RPM离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml培养液，重悬混匀后分装至新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书配置的新完全培养基以保持细胞生长活力，后续传代按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存及复苏步骤

1. 当细胞覆盖养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞；

2. 添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液至培养瓶中，观察至细胞回缩变圆后，加入5ml完全培养基终止消化；接着轻轻吹打细胞使其脱落，并转移至15ml离心管，1000RPM离心5分钟；

3. 弃去上清，加入1ml的Z6·尊龙凯时无血清冻存液，混匀后转移至冻存管中；

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱存储，如需转入液氮罐，请先在-80℃保存24小时以上。

复苏步骤：1. 从液氮中取出冻存管，迅速置于37℃水浴解冻，直至无结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁；2. 将细胞移至含5ml完全培养基的离心管中，1000rpm离心5分钟；3. 弃去上清，重新用5ml完全培养基重悬细胞，接种至T25培养瓶，放于37℃、5% CO2的培养箱中；4. 第二天更换新鲜完全培养基继续培养。

### 注意事项

某些细胞的贴壁性不强，在运输过程中可能会脱落，这属于正常现象。如脱落较多，可将培养瓶中的培养液收集至离心管中，进行1000 RPM离心5分钟，收集的上清可用于后续的对比培养。沉淀细胞后，加入1-2ml胰酶轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基终止反应，随后再进行离心、重悬工作，并按1:2的比例进行分瓶传代（两个T25），补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中继续培养。